快速现场评价（RapidOnSiteEvaluation，ROSE）使肺脏介入病学专家真正拥有病理维度并借此审视临床。ROSE本质上属于快速细胞病理学范畴，因此对染色细胞、微生物及染色背景的识别是ROSE判读的核心，判读的前提是规范的ROSE染色操作。本文通过介绍ROSE染色步骤和注意事项，同时汇总介入肺脏病学中ROSE常见的正常/肿瘤细胞类型和判断陷阱，旨在尽可能地为非病理科ROSE同道提供细胞评价经验并避免判断陷阱，同时结合ROSE临床实践分析其具体应用与体会。
一、ROSE起源与发展
ROSE是对所获标本进行现场制片和快速染色，依据形态学评价所获标本类型和性质，旨在提高获取标本质量和疾病诊治效率的一种技术。ROSE在介入肺脏病学中的应用最早可追溯到年[1]，随后研究发现在肺穿刺或组织活检过程中ROSE有助于提高疾病诊断率及准确性[2-4]；使用ROSE还能明显减少活检次数和操作相关并发症[5]；在确定肺癌淋巴结分期方面，若ROSE确认N3区淋巴结转移，则可避免其他区域淋巴结的穿刺。使用ROSE还可以减少肺癌诊断时间和花费[6]，由病理医生参与的ROSE与组织病理一致率为89.1%，无假阳性，假阴性为4.8%～5.7%[7-8]，因此世界支气管和介入肺脏病学联盟在经支气管镜肺活检术（TBLB）/经支气管镜针吸活检术（TBNA）指南中推荐使用ROSE。ROSE的根基是对染色细胞和染色背景的识别，识别的前提是正确的ROSE操作和判读。随着ROSE应用的深入，有必要重新认识ROSE在临床中的应用。
二、ROSE材料与操作
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ROSE所需材料
显微镜及成像系统，Diff-Quik染液，无菌生理盐水，无菌载玻片，20mL无菌注射器针头，吸水纸，计时器，铅笔[9]。
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ROSE操作步骤
1、制片
标记患者信息于载玻片，将刷检、TBNA、TBLB、胸腔镜活检组织、肺穿刺组织均匀薄涂成类圆形涂片。涂片时尽量清除水分，空气风干10s。
2、染色
将载玻片染色端浸入Diff-Quik染液A（主要成分是酸性曙红和甲醇，使细胞质、胶原蛋白和肌肉组织着红色）中20～30s；无菌生理盐水浸洗，吸水纸清除多余水分；再浸入Diff-Quik染液B（主要成分是碱性亚甲蓝，使细胞核、真菌着蓝色）中20～30s；无菌生理盐水浸洗载玻片，拭干后显微镜下观察。
3、观察
先低倍后高倍，先观察异常细胞后观察正常细胞，从上到下，由左及右，20s左右完成阅片并将结果反馈至操作者，向操作者汇报阅片结果，若有恶性倾向，需进一步评估异型细胞所占比例，最后记录阅片结果待组织病理回报后比对。
观察时有以下注意事项：（1）Diff-Quik染液不用时应密封防止溶剂挥发；（2）每个月纱布过滤或更新染液，减少染色背景；（3）可根据着色深浅调整染色时间以求最佳染色效果；（4）Diff-Quik染液A液与B液均具有刺激性，染液A含有叠氮钠，操作者应做好防护。
三、介入肺脏病学中ROSE判读
介入肺脏病学涉及ROSE判读的细胞主要来源是肺实质（各级气管和肺泡）和肺间质（血管、淋巴结/管、结缔组织、神经组织及间皮组织），后续内容也将围绕这两部分展开。
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常见肺实质细胞
1、正常肺实质细胞
常见的肺实质细胞主要有黏膜层细胞（纤毛细胞、刷细胞、杯状细胞、基底细胞和小颗粒细胞）、远端气道细胞（远端气道上皮和组织细胞）及肺泡细胞（成纤维细胞、巨噬细胞和Ⅰ/Ⅱ型肺泡上皮）[10-11]。纤毛细胞因其顶端标志性纤毛而具有较高识别度，其细胞核呈类圆形并有细腻的核仁，多见尾丝，纤毛细胞随气道延伸移行为远端气道上皮。ROSE涂片中纤毛细胞多聚集出现，形态规整，其大小可作为衡量异型细胞的标尺。ROSE涂片中另一类柱状上皮细胞是刷细胞，其表面有微绒毛，占比较少，与纤毛细胞体积相当且常与纤毛细胞伴行出现。杯状细胞因形似高脚杯而得名，可分泌黏液，细胞质淡染，多有偏心的细胞核，哮喘和慢性肺炎患者气道黏膜可见增多的杯状细胞。基底细胞具定向分化成纤毛细胞和杯状细胞的潜能，因此其核浆比较大，呈类圆形且多成团出现，可有明显核仁，易被误认为是肿瘤细胞（图1）。
图1：常见的近端气道上皮细胞（Diff-Quik×）
可见典型的纤毛柱状上皮细胞（红箭）、刷细胞（黄箭）及基底细胞（绿箭），其见夹杂大量红细胞（黑箭）。
肺泡中的纤维细胞多为梭形，多以细胞群出现，细胞核位于细胞短径中央，核仁不明显。Ⅰ型肺泡上皮细胞呈扁平状，数量较少，较难观察。Ⅱ型肺泡细胞属立方上皮，形似「倒扣碗」状，胞质较丰富，着色较均一。肺泡损伤可导致Ⅱ型肺泡上皮增生。巨噬细胞源于单核细胞，由于巨噬细胞多存在于肺泡中，因此常被用来评估取材部位和深部痰标本是否合格。巨噬细胞胞质淡染，胞质内含较多细小空泡，细胞膜不规则，吞噬灰尘颗粒后变为尘细胞。巨噬细胞吞噬过多红细胞形成含铁血黄素细胞，尘细胞和含铁血黄素细胞的区别在于前者细胞背景有较多的灰尘颗粒，结合病史和气管镜下碳末沉积的黏膜表现不难对二者进行识别。组织细胞亦来自于血液中单核细胞，组织细胞可分化为类上皮细胞，类上皮细胞呈不规则「瘦长」型，多个类上皮细胞组成多核巨细胞，多核巨细胞可见于异物、病毒感染等代谢产物积累等情况，多核巨细胞进一步扩展形成肉芽。肉芽肿性疾病种类繁多，最常见的结核性肉芽肿多伴淋巴细胞浸润和坏死背景，而结节病则有较少的淋巴细胞浸润，无明显坏死背景（图2）。
图2：常见的远端气道上皮细胞（Diff-Quik×）
a.增生的Ⅱ型肺泡上皮细胞；b.类上皮细胞构成的肉芽肿；c.多核巨细胞；d.巨噬细胞。
2、常见的异常肺肿瘤细胞
根据临床常见的肿瘤类型，本文重点介绍鳞癌、腺癌、小细胞肺癌等经典的肿瘤细胞辨别。由于鳞癌与腺癌均起源于细支气管肺泡干细胞[12]，因此二者细胞核均较大（3个红细胞），核浆比1/2，染色质聚集形成较为明显的核仁。分化较好的腺癌细胞体积增大，细胞核类圆形，一致性好，分泌活跃而导致胞质深染且易聚集成团，大小差异和挤压程度不及鳞癌。腺癌血供丰富且易早期转移，因此多红细胞背景，有时TBNA更易获得腺癌组织且更易评价。鳞癌分化较腺癌差。鳞癌细胞体积显著增大且多伴角化，细胞核畸形明显，差分化鳞癌可有裸核，淡染的胞质与浓染的细胞核形成「煎蛋样」改变，恶性程度不同导致鳞癌细胞间有较大的体积差异。鳞癌血供不丰富易发生坏死，故细胞间的相互挤压和坏死背景也是鳞癌特征。小细胞肺癌属神经内分泌肿瘤，起源于胺前体摄取脱羧化细胞[13]，小细胞肺癌细胞体积并不小，其具有较大的细胞核，可有核仁，小细胞肺癌细胞分化最差，坏死常见，裸露的细胞核奇形怪状且相互挤压、叠加和镶嵌，细胞间缺乏连接导致分散性较好，但其无细胞质保护且细胞核疏松，涂片过程较易导致核拉丝和过度聚集（图3）。
图3：典型的肿瘸细胞（Diff-Quik×）
a.高分化鳞癌细胞呈「煎蛋样」，贫瘠/甚至缺如的胞浆和不规则的胞核；b.高分泌状腺癌，丰沛的胞浆、类圆形胞核和浓染的核仁；c.差分化小细胞肺癌，无胞浆（裸核）、易碎（拉丝状）和「丑陋」的胞核。
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常见肺间质细胞
ROSE可见的肺间质细胞主要包括红细胞和有核细胞（淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞等）。红细胞直径约7～9μm，因其无核、胞浆淡染、双凹面结构、绝少异型、聚集出现等特征导致其最易被辨别，常被作为ROSE的标尺细胞用于鉴别细胞良恶性。淋巴细胞是最常见的有核血液系统细胞。正常淋巴细胞与红细胞大小相当，细胞浆较少且有深染的胞核。淋巴细胞可分化为B淋巴细胞时，开始出现淡蓝的胞浆，淡蓝色胞浆进一步增加则是B淋巴细胞分化为成熟浆细胞。单核细胞体积是与2个红细胞相当。单核细胞的细胞核不规则，细胞核无分页且易偏心于胞质一侧，核浆比较高但细胞体积不大。最重要的是，由于单核细胞需要经由毛细血管间隙变形进入组织，因此其细胞核常畸形扭曲，这与类圆的细胞膜形成鲜明对比。进入组织后单核细胞可分化为巨噬细胞和组织细胞等。中性粒细胞体积约是红细胞的2倍，其易聚集出现的特性和典型的核分页使其易于辨别。淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞是感染超家族成员，三者出现最常见的原因就是感染。嗜酸粒细胞尽管较少出现，但它的出现的临床意义较。嗜酸粒细胞大小与形态均与中性粒细胞相当，前者多2个核分页，后者多3个核分页，关键的鉴别在于嗜酸粒细胞胞质内含有嗜酸性颗粒，ROSE可见嗜酸粒细胞胞质内点状分布的红染的嗜酸颗粒（图4）。
图4：典型感染性组织的ROSE表现（Diff-Quik×）
可见各分化阶段的中性粒细胞，呈弥漫、分页状。
四、介入肺脏病学中快速现场评价常见判断陷阱
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基底细胞与异型细胞
初学者较易将基底细胞误判做腺癌。基底细胞作为储备细胞，具有一定分化潜能，基底细胞多聚集出现，多呈葡萄状平铺于视野，较高的核浆比和类圆形结构使其较易误判为腺癌。鉴别要点在于正常基底细胞的体积仅较红细胞稍大，基底细胞虽聚集出现但细胞间无竞争性和挤压性生长倾向，细胞大小均一，而多数腺癌细胞体积多大于3个红细胞，腺癌细胞间体积差异较大并呈竞争性生长。需要注意的是，当基底细胞增生时其体积可倍增，其与腺癌的鉴别难度将陡增，根据腺癌类圆形、小病灶大转移以及其他临床影像学资料可协诊。早期浸润腺癌由于生长微环境优越，导致其分化较好，较均匀的类圆形胞体极具迷惑性，判读者较难定论其恶行性，但其增粗的染色质和影像学改变均有助于其恶行性的判读（图5a、b）。
图5：典型的ROSE识别「陷阱」（Diff-Quik×）
a.高分化腺癌呈葡萄状，深染且大小均一，但较背景红细胞大2～3倍；b.密集的基底细胞，其胞核与红细胞、刷细胞相当；c.淡染的成纤维细胞，有方向性、结构稍紧密、整体「飘逸」；d.TBNA涂片，示激活的T淋巴细胞（红箭），胞质疏松，整体圆形，背景可见正常淋巴细胞（黄箭）和激活的B淋巴细胞（蓝箭）；e.柱状上皮化生鳞状上皮，细胞整体鱼鳞状，细胞浆均匀染色，细胞核类圆形且大小均一，位于细胞中心，整体「面善」。
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成纤维细胞与异型细胞
成纤维细胞多出现在肺损伤修复期，在过度修复的肺损伤过程中，过多的成纤维细胞进入肺泡中分化成纤维细胞从而构成Masson小体[14]。成纤维细胞体积与肿瘤细胞相当或更大，核浆深染，偶可见到浓聚的核仁。当成纤维细胞增生成团聚集的情况下实难与肿瘤细胞鉴别，但成纤维细胞整体修长（似梭形）、核浆比不高、无挤压式生长、相对整洁的细胞背景仍暗示其无恶性潜能（图5c）。
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激活的淋巴细胞与异型细胞
在TBNA过程中最常见的判读陷阱是激活的淋巴细胞。淋巴细胞受协同刺激分子刺激后被激活，激活的淋巴细胞体积为红细胞的2～3倍，且核浆比可1/2，多成团出现，核浆比1/2，多具有淡染的细胞浆，极易与肿瘤细胞混淆，但其细胞核着色较浅、染色质疏松、罕见的染色质浓聚及较好的分散度仍暗示其良性本质。需要注意的是当大量原始淋巴细胞（细胞体积3个红细胞，核浆比1/2）聚集需警惕淋巴瘤与神经系统肿瘤（图5d）。
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鳞状上皮恶性病变过程
鳞状上皮化生是另外一个需要鉴别的陷阱。正常气道上皮细胞对病原体、放化疗、气道内烧伤、微环境改变的反应可导致鳞状上皮化生[15]。鳞状上皮化生不能一概被认为是癌前病变。轻度鳞状上皮化生主要表现为多边形平铺或卷曲的细胞类型，细胞间连接尚紧密，细胞质着色较浅，细胞核椭圆形着色较深，核浆比不高，染色质聚集不明显，较易得出良性判断。但鳞状上皮化生可发展为不典型增生甚至低/高级别上皮内瘤变，其最主要的变化在于核浆比逐渐增加，染色质逐渐增粗，直至显著的核异型增生，细胞核大于3个红细胞，「煎蛋样」着色，细胞排列紊乱（图5e）。
五、ROSE的应用体会
ROSE属于快速细胞病理学范畴，其核心是快速评价并实时反馈，初学者可经短期学习掌握经典细胞类型、微生物类型和细胞背景的判读，但需要经历较长的学习曲线才能较好地运用ROSE，特别是在初始阶段受挫后需要更大的勇气继续ROSE判读。ROSE协助介入肺脏病学取到真正的足够多的病变组织以满足后续诊治，对于直视病灶或由影像引导（EBUS-TBNA/GS、CT引导肺穿刺及虚拟导航）取材的病灶，ROSE可对所获标本中有诊断意义部分进行评估并指导送检。对于不可直视病灶取材操作（TBLB/TBNA），ROSE的作用将更加凸显，特别对高难度或高风险的活检，或者在患者不耐受等意外情况下，ROSE可让操作者从容停止操作而非继续冒险取材，ROSE的应用既降低操作风险又能协助诊断。另外，根据ROSE结果可以提前分流患者，从而降低患者住院天数和花费，提高收治效能。ROSE让临床医生便拥有了病理学维度，然而ROSE发挥以上作用的前提是正确判读，只有降低误判，才能使ROSE获益于临床和患者。
近年来，呼吸介入的高精尖设备越来越多，患者负担越来越重，呼吸介入医师取材压力越来越大。ROSE能减轻取材压力，特别是在肿瘤性疾病方面，病灶取材与定性难度越大，ROSE作用越强。不容回避的是，ROSE也有其适应证，并非所有病灶都需要ROSE协助诊断，或者说ROSE在某些病灶取材过程中作用不大。对于娴熟的介入肺脏病学专家来说，ROSE仅是锦上添花，因为他们有其他判断取材的方法和技巧。另外，从病理学角度看，ROSE仅观察二维平面的细胞学改变，缺乏对立体的组织学结构进行评估。目前各呼吸介入中心ROSE水平参差不齐，ROSE入门不难，但想拥有高水平的判读能力，就要耗费漫长的时间和精力，只有这样才能避免只把ROSE当做噱头，而无切实应用的尴尬局面。因此，要分门别类、不偏不倚地评估ROSE作用。
在进行ROSE临床实践中，我们曾遇到两个问题，一是不能出具公认报告，二是无法收费。首先ROSE目的是评估活检组织是否达到临床要求，ROSE的核心是「实时反馈」，而非获得出具公认报告这一「名分」。既然ROSE能够帮助获得足够多的病变组织并指导标本送检，能否出具公认报告便不那么重要。关于第二个问题，ROSE涂片材料成本较低，科室完全可以负担；另外，ROSE带来的效益远大于成本，例如ROSE可降低患者二次检查风险、减少操作时间、减轻患者痛苦、增加呼吸介入初学者信心、增强呼吸介入团队凝聚力、提升本单位呼吸介入综合水平等，因此有无收费条目也显的不那么重要。随着医疗政策的完善，相信这两个问题都能得到解决。笔者坚持实用主义原则，若某技术利于临床和患者，那么该技术就应开展，因此我科将ROSE常规应用于气管镜、肺穿刺、胸腔镜及二次活检标本的质控中，并已从中获益。
本文局限于对恶性肿瘤的判读，但顶级的ROSE判读者已将其应用在感染性疾病以及非肿瘤非感染性疾病中。特别是在传统的病原学检测已经无法满足现实临床需要情况下，很有必要发掘新的病原学检测模式。ROSE不仅能指导获取反映疾病原貌的病灶组织，而且还能初步区分感染类型并指导后续送检和诊治方向，协助患者快速分流，这些作用均为发展新的病原学检测模式提供契机。例如我们的临床实践中，若ROSE证实穿刺组织或肺/淋巴结内有肉芽肿及无定型坏死物，我们会加送抗酸染色；另外，若ROSE证实为细菌/病毒/真菌等感染性疾病，可直接送活检组织行二代测序（NGS）检测，并限定重点检测范围，这样既可增加NGS检出阳性率，又可以减少患者检查费用。最后需要强调的是，任何精妙的介入肺脏病学操作和高水平的ROSE判读都离不开对患者临床信息的研读，在病理医生缺位的情况下，临床医生应当充分利用掌握临床信息这一绝佳优势并承担ROSE判读的工作。
利益冲突：本研究不涉及任何利益冲突。
参考文献略。
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